實驗專欄---PEI 細胞轉(zhuǎn)染

      陽離子聚合物 - 聚乙烯亞胺（PEI）是目前報道的工業(yè)化、大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染表達重組蛋白領(lǐng)域使用的基因載體和轉(zhuǎn)染試劑。人胚胎腎細胞（HEK293）和中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞是目前工業(yè)大規(guī)模瞬時轉(zhuǎn)染領(lǐng)域使用的宿主細胞。PEI 是基因載體中的陽離子聚合物之 一，因為其具有高的轉(zhuǎn)染效率，所以作為基因轉(zhuǎn)染的黃金標準而常被用來參照。 PEI 形成復合物的分子量通常在 5 ～ 25 kDa之間。高分子量 PEI 一般比低分子量 PEI 有 更高轉(zhuǎn)染效率，但問題在于，高分子量的 PEI 往往有 較高的細胞毒性， 這一規(guī)律與其他聚陽離子類似。目前主要有三種主流方法：生物轉(zhuǎn)染，物理轉(zhuǎn)染和化學轉(zhuǎn)染。化學轉(zhuǎn)染方法是生物醫(yī)學研究中轉(zhuǎn)染方法，主要包括兩類：陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物。其基本原理是利用陽離子的化學分子與帶有負電荷的核酸通過正負電荷作用形成穩(wěn)定的復合物。

PEI轉(zhuǎn)染機制

目前使用的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑是 PEI。PEI 制備簡單，價格便宜，有線狀和枝狀兩種商業(yè)試劑可選，是瞬時轉(zhuǎn)染放大轉(zhuǎn)染試劑的*，是非常有潛力的非病毒質(zhì)粒載體試劑。
由于PEI 帶正電荷，與帶負電荷的DNA 結(jié)合形成帶正電荷的 PEI-DNA 復合物，可以與帶負電荷的細胞表面結(jié)合。PEI-DNA 復合物通過胞吞作用進入細胞內(nèi)部形成內(nèi)涵體，之后一部分從內(nèi)涵體中逃逸進入細胞核內(nèi)，未逃逸的進入溶酶體被降解，無法入核的 DNA 會在 100 min 內(nèi)被胞漿中的 DNA 酶降解。

PEI轉(zhuǎn)染過程

1. 細胞培養(yǎng)

２９３Ｔ 細胞培養(yǎng)于 ＤＭＥＭ［含 １０％胎牛血清（ＦＢＳ）中］，置于 ３７ ℃、５％ＣＯ２ 條件下連續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24ｈ 將細胞接種于６孔板中，每孔 ５×１０５ 個細胞且均勻分布，用于轉(zhuǎn)染.

2.２９３Ｔ 細胞轉(zhuǎn)染

取 ６ 孔板細胞，ＰＢＳ 緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)染組細胞分別加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合和 ＰＥＩ 轉(zhuǎn)染混合液，對照組加 入 等 量 無 血 清 ＤＭＥＭ，邊 加 邊 混 勻，３７ ℃，５％ＣＯ２ 培養(yǎng) ６ ｈ。轉(zhuǎn)染后去除轉(zhuǎn)染混合液，每孔加入*培養(yǎng)基２ ｍＬ 繼續(xù)培養(yǎng)，４８ ｈ 后檢測轉(zhuǎn)染效果。

3. 細胞活性檢測

采用 ＣＣＫ-８ 試劑盒進行檢測

4. 轉(zhuǎn)染后綠色熒光觀察及監(jiān)測表達

在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染48ｈ后帶有綠色熒光的細胞比例，有綠色熒光說明轉(zhuǎn)染成功。

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